自体脂肪源性干细胞对由放射诱导的猪的慢性创面的效果以及电离辐射对活体内脂肪源性干细胞的影响

【摘要】研究背景慢性创面在临床上比较棘手。过去已经进行了大量的工作以促进慢性创面的愈合。但是,由于缺乏与人类病理生理学相似的前期的动物模型,慢性创面的新治疗方法的研究进展受到阻碍。为了研究各种实验治疗因素的潜在效应,既往已经成立了各种慢性创面的动物模型。由于猪和人类的解剖学和生物学的相似性,甚至是对电离辐射的时间和剂量依赖性的反应的相似性,因此猪是慢性创面模型的最佳实验动物对象。既往已经有用约克郡猪和尤卡坦猪制作慢性创面模型的相关文献。但不足之处在于如果猪的生长速度太快,将影响实验治疗因素的研究结果,因为不同年龄的猪全厚创面愈合的速度和细胞因子的水平是不同的。另外,放射后选择什么时候作为制作慢性创面模型更为合适呢?既往的文献报道了体外实验中,低剂量的激光辐射能对人脂肪干细胞产生积极的影响。众多文献记录了诸如神经干细胞,间质干细胞,造血干细胞等人类干细胞对电离辐射的反应和特征变化。人骨髓源性干细胞能够保持它们的干细胞特征。然而,这些实验基本上都是在体外以及低剂量的辐射条件下(<10Gy)进行的,很少有在体内实验以及高剂量的电离辐射条件下进行的实验报道。因此,我们的第二个实验假想是,在电离辐射后的不同时期,比较活体内的放射损伤脂肪干细胞与正常的脂肪干细胞的不同。脂肪干细胞分泌许多潜在的有利于创面愈合的生长因子和细胞因子。本实验中,我们通过放射依据放射后的不同时间在小型猪身上制作慢性创面模型,然后在慢性创面进行自体脂肪干细胞移植,比较自体脂肪干细胞和空白对照液对慢性创面愈合的效果。目的1、采用小型猪,通过放射即电离辐射,根据放射后的不同时间点,分别比较放射后2周、4周和6周的情况,来创建一个标准化的慢性创面模型,以利于对慢性创面愈合的实验研究。2、比较放射后2周、4周和6周分离获取的活体内放射损伤的脂肪干细胞(r-ADSCs)和正常脂肪干细胞(n-ADSCs)两者的增殖能力、分化能力以及免疫分型,了解大剂量的电离辐射对活体内脂肪干细胞的影响。3、在由放射诱导的慢性创面,使用自体脂肪源性干细胞的局部注射移植,检验单一使用自体脂肪干细胞对慢性创面模型的效应。方法一、小型猪背部的放射的实施及其优化实验经过替来他明-唑拉西泮注射液(Zoletil(?);VirbacLaboratories,Carros,France)和盐酸甲苯噻嗪注射液(Rompun(?);Bayer,Lerverkusen,Germany)的注射,麻醉起效后,将猪运送至肿瘤放射治疗科。在每一头猪的背上选取三个大小为18×8cm的区域,暴露于直线加速器下,每一个区域接受剂量为18Gy的单次照射。照射完毕后,将实验动物猪运送到动物实验中心,并在标准条件下饲养两周。二、正常脂肪干细胞(n-ADSCs)和放射损伤脂肪干细胞(r-ADSCs)的准备在建立创面模型时,在脊柱旁的非放射区域和放射区域,从切除的组织获取皮下脂肪组织,分别用以分离培养正常脂肪干细胞(n-ADSCs)和放射损伤脂肪干细胞(r-ADSCs).将切下来的脂肪组织清洗,剁碎,Ⅰ型胶原蛋白酶消化,离心,细胞团悬浮,过滤,再次离心,最后将细胞种植在100(?)的培养皿中,置于37℃并含有5%CO2的培养箱内。定期更换细胞培养液。第一代的脂肪干细胞冻存备用。培养至第三代的自体脂肪干细胞用于干细胞移植以治疗创面。依据创面建立的时间,放射损伤脂肪干细胞(r-ADSCs)分为三个组：(1)放射后2周获取的放射损伤脂肪干细胞组(2R组),(2)放射后4周获取的放射损伤脂肪干细胞组(4R组),(3)放射后6周获取的放射损伤脂肪干细胞组(6R组)。类似的,正常脂肪干细胞(n-ADSCs)也分为三个组：(1)放射后2周获取的正常脂肪干细胞组(2N组),(2)放射后4周获取的正常脂肪干细胞组(4N组),(3)放射后6周获取的正常脂肪干细胞组(6N组)。三、放射损伤脂肪干细胞(r-ADSCs)和正常脂肪干细胞(n-ADSCs)的分析比较对放射2周组(2R组),放射4周组(4R组),放射6周组(6R组),正常2周组(2N组),正常4周组(4N组),正常6周组(6N组)的脂肪干细胞进行以下比较分析：1.采用CCK-8细胞计数试剂盒进行细胞增殖能力的分析比较,并通过细胞计数仪描记结果以绘出细胞生长曲线；2.β-牛乳糖关联的细胞老化分析(Senescence-associatedβ-galactosidase);3.细胞菌落集成分析(ColonyFormingUnits-Fs分析)；4.免疫表型分析,包括CD31,CD45,CD29,CD90;5.脂肪分化能力和成骨分化能力的分析。四、创面模型的建立和自体脂肪干细胞的在实验组创面的注射移植每一只小型猪总共有3次创面模型的建立,即分别在：(1)电离放射后2周,(2)电离放射后4周,(3)电离放射后6周。即是说,依据创面建立的时间,创面分为三个大组：(1)放射后2周建立的放射创面和放射后2周建立的正常创面,(2)放射后4周建立的放射创面和放射后4周建立的正常创面,(3)放射后6周建立的放射创面和放射后6周建立的正常创面。每一次创面模型的建立,每一只猪有三个创面形成,其中包括两个放射创面和一个正常创面。前者,即两个放射创面将在后续的实验中被随机分成未接受自体脂肪干细胞注射移植的阳性对照组和接受自体脂肪干细胞注射移植的实验组。每一个创面的大小为边长4cm的正方形,创面边缘距离放射区域的边界为2cm,两个创面间隔为6cm。标记于脊柱另一侧的非放射区域的正常的创面为阴性对照组。建立创面时,切除的组织包括皮肤和浅层脂肪组织,不包括深层脂肪组织,创面的深度大约为1.5至2.0cmm。总共有18个创面,其中6个正常创面,12个放射创面。从12个放射创面中再随机选择出一半接受脂肪干细胞移植的放射创面,以接受自体脂肪源性干细胞的注射移植。注射部位位于距离创面边缘大约5mm的真皮和浅层脂肪层之间的皮下区域,所有接受自体脂肪干细胞移植的创面分别在创面建立后4周和6周各接受干细胞移植一次。每一次接受注射移植的细胞数量大约为10×106个/2mlDMEM(1×106-2×106cells/1cm2创面)。为了测试各个创面组的愈合速度,在建立创面后开始每周用数码相机对每个创面进行拍照。然后将相片上传至计算机,用Visitrak创面分析仪(Smith&Nephew,Australia)进行数据分析。在脂肪干细胞移植治疗前,对建立于放射后第2,4,6周的放射创面和正常创面,在创面建立后0,2,4周分别取活组织检查。最后在创面建立后9周,对未接受自体脂肪干细胞移植的放射创面组,接受自体脂肪干细胞移植的放射创面组,正常创面组进行活组织检查。切片用苏木精和曙红(H&E)染色,以进行常规的组织学分析。五、统计方法实验数据采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析,计量资料的数据采用(x±s)表示。关于电离辐射对脂肪干细胞的影响的分析采用one-wayANOVA方法进行多样本均数比较,先做方差齐性检验,若方差齐,各组间存在差异,则采用LSD法和Bonferroni法检验法进行组间多重比较；方差不齐,采用Welch检验,若各组间存在差异,采用DunnettT3检验法进行组间多重比较,以P<0.05示差异有统计学意义。关于创面的数据分析采用重复测量法(RepeatedMeasures)进行统计学分析。若有交互效应则进一步进行单独效应分析,即固定时间点,组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用LSD方法；固定组别,不同时间点之间的比较采用重复测量方差分析,多重比较采用LSD方法。P值<0.05时认为有统计学差异。结果一、放射损伤脂肪干细胞(r-ADSCs)和正常脂肪干细胞(n-ADSCs)的分析比较1、细胞增殖能力结晶紫染色后,放射6周组(6R)的细胞形态不均一且明显变小,而放射2周组(2R)、放射4周组(4R)、正常2周组(2N)、正常4周组(4N)、正常6周组(6N)之间相似(图2-1.A)。从细胞的生长曲线上看,放射2周组(2R)和放射4周组(4R)的细胞生长速度相似。仅在培养后第9天(F=13.545,P=0.002)和第15天(F=339.589,P=0.000),放射4周组(4R)的细胞生长显著慢于正常组和放射2周组(2R)(第9天：P=0.022和P=0.036,第15天：P=0.006和P=0.002),在第21,27,30天,放射4周组与正常组和放射2周组组间无显著差异。在第21天时(F=12.003,P=0.002),放射6周组(6R)的细胞生长速度与正常组、放射2周组(2R)、放射4周组(4R)相比较显著性的减弱(P=0.000,P=0.020和P=0.001)。在第27天时(F=1.953,P=0.200),放射6周组(6R)的细胞生长速度与正常组、放射2周组(2R)、放射4周组(4R)相比较显著性的减弱(P=0.004,P=0.039和P==0.048)。在第30天时(F=0.579,P=0.645),放射6周组(6R)的细胞生长速度与正常组、放射2周组(2R)、放射4周组(4R)相比较显著性的减弱(P=0.000,P=0.000和P=0.001)(图2-1.E,表1)。CCK-8分析结果显示,在含10%胎牛血清的细胞培养液中,正常组的脂肪干细胞在培养第5天(F=1.623,P=0.229)的增殖速度显著快于放射2周组(2R)、放射4周组(4R)和放射6周组(6R)(P=0.032,P=0.013和P=0.026)；正常组的脂肪干细胞在培养第7天(F=1.104,P=0.380)的增殖速度显著快于放射2周组(2R)、放射4周组(4R)和放射6周组(6R)(P=0.009,P=0.001和P==0.000)；正常组的脂肪干细胞在培养第9天(F=2.208,P=0.124)的增殖速度显著快于放射2周组(2R)、放射4周组(4R)和放射6周组(6R)(P=0.018,P=0.028和P=0.000)；正常组的脂肪干细胞在培养第11天(F=0.577,P=0.640)的增殖速度显著快于放射2周组(2R)、放射4周组(4R)和放射6周组(6R)(P=0.000,P=0.013和P=0.000)(图2-1.F,表2)。在放射2周组(2R)、放射4周组(4R)和放射6周组(6R)三者之间在培养第5,7,9,11天的增殖速度无统计学差异。同时,在用含1%胎牛血清的细胞培养液作为细胞压力测试的过程中,放射6周组的细胞增殖速度则显著快于正常组、放射2周组、放射4周组：放射6周组(6R)的脂肪干细胞在培养第1天(F=1.044,P=0.404)的增殖速度显著快于正常组(N)、放射2周组(2R)和放射4周组(4R)(P=0.000,P=0.000和P=0.001)；放射6周组(6R)的脂肪干细胞在培养第3天(F=0.858,P=0.485)的增殖速度显著快于正常组(N)、放射2周组(2R)和放射4周组(4R)(P=0.000,P=0.000和P=0.000)；放射6周组(6R)的脂肪干细胞在培养第5天(F=1.049,P=0.402)的增殖速度显著快于正常组(N)、放射2周组(2R)和放射4周组(4R)(P=0.000,P=0.000和P=0.000)；放射6周组(6R)的脂肪干细胞在培养第7天(F=0.964,P=0.437)的增殖速度显著快于正常组(N)、放射2周组(2R)和放射4周组(4R)(P=0.000,P=0.000和P=0.000)；放射6周组(6R)的脂肪干细胞在培养第9天(F=4.696,P=0.018)的增殖速度显著快于正常组(N)、放射2周组(2R)和放射4周组(4R)(P=0.000,P=0.001和P=0.001)；放射6周组(6R)的脂肪干细胞在培养第11天(F=23.895,P=0.000)的增殖速度显著快于正常组(N)、放射2周组(2R)和放射4周组(4R)(P=0.011,P=0.011和P=0.011)(图2-1.G,表3)。有可能是因为放射6周组的细胞能够耐受1%胎牛血清的细胞压力测试环境。在正常2周组、正常4周组、正常6周组,β-牛乳糖关联的细胞老化分析的免疫染色阳性物质较少见,但在放射6周组显得更常见(图2-1.B)。四组之间(F=49.517,P=0.002),但与正常组相比较,放射6周组的脂肪干细胞集落形成显著减少(P=0.013)。而正常组、放射2周组、放射4周组之间无显著差异(图2-1.C,D,表4)。2、免疫分型用流式细胞仪对放射损伤脂肪干细胞(r-ADSCs)和正常脂肪干细胞(n-ADSCs)的免疫分型进行分析。结果显示放射损伤脂肪干细胞和正常脂肪干细胞都表达CD29和CD90表面抗原,而不表达造血系和内皮系标志物即CD31和CD45。3、细胞分化能力用脂肪细胞分化诱导培养液培养后,正常组脂肪干细胞被诱导分化为脂肪细胞系,在诱导后第14,20天被油红O染色证实(图2-3.D,E)。这个脂肪细胞分化现象同样可见于放射2周组和放射4周组细胞,但脂肪细胞分化能力依次减弱。在诱导后第14天,正常组、放射2周组、放射4周组、放射6周组之间脂滴形成无显著差异(F=2.950,P=0.222)。在诱导后第20天(F=12.370,P=0.009),放射6周组内几乎看不见脂滴的形成,放射6周组与正常组、放射2周组均有显著差异(P=0.012,P=0.047)。正常组与放射2周组、放射4周组之间均无显著差异(图2-3.F,表5)。同样的,用成骨分化诱导培养液培养后,脂肪干细胞被诱导分化为成骨细胞,在诱导后第7,14,20天被碱性磷酸酶(AP)(图2-4.D,E,F)和茜素红S染色证实(图2-4.G.H.I)。作为早期的成骨分化标志物,在诱导后第7天所有的组内均可见碱性磷酸酶的活性表达。在诱导后第14天,所有组内碱性磷酸酶活性表达受到抑制,然而此时在所有组均可观察到骨样结节(bone-likenodules)的形成。在诱导后第18天,所有组内碱性磷酸酶活性表达增强,同时所有组均形成的骨样结节变得更大,颜色也更深。有趣的是,在放射2周组由对硝基苯基磷酸酯(pNPP)检测的表达碱性磷酸酶活性的物质含量最高,但是正常组、放射2周组、放射4周组、放射6周组四个组之间无显著差异(F=27.247,P=-0.000)(图2-4.J,表6)。在诱导后7天,所有组均可观察到由茜素红S染色显示的矿物质的沉积现象。在第14天和第18天则整体逐渐增强。在诱导后第18天,与AP活性测定结果一样,放射2周组茜素红S染色在四个组内最为强烈,但各组间无显著差异(F=1.594,P=0.247)(图2-4.K,表7)。另外,在正常组和放射组之间,可以观察到细胞集落群的形态是有所不同的。在正常组,细胞集落群的分布显得更均匀。二、创面愈合1、创面愈合速度对正常组创面来讲,创面的肉芽组织更新鲜,生长的速度也更快,在创面建立后1周即可见到明显的创面缩小。但对于放射组,创面的肉芽组织呈现为灰色,生长缓慢。与放射后2周组的放射创面相比较,放射后4周组的放射创面形成更明显的质地坚硬的痂皮。而放射后6周组的放射创面则更严重。本实验中,创面愈合速度的评定主要是依据大体标本创面的上皮化形成来进行分析。创面建立后每周一次对创面进行数码相机拍照。对正常组创面来讲,创面的肉芽组织更新鲜,生长的速度也更快,在创面建立后1周即可见到明显的创面缩小。但对于放射组,创面的肉芽组织呈现为灰色,生长缓慢。与放射后2周组的放射创面相比较,放射后4周组的放射创面形成更明显的质地坚硬的痂皮。而放射后6周组的放射创面则更严重。本实验中,创面愈合速度的评定主要是依据大体标本创面的上皮化形成来进行分析。创面建立后每周一次对创面进行数码相机拍照(图3-2A)。对于放射后三个时间点即放射后2周、放射后4周以及放射后6周分别建立创面对建立慢性创面的效果评价,三个重复测量因素分别为：位点group(不接受放射的位点0即正常组创面,放射位点1即未接受脂肪干细胞注射移植的创面,和放射位点2即接受脂肪干细胞注射移植的创面)、放射后开始造模时间因素model(放射后2周、放射后4周和放射后6周)、造模后观测时间因素time(创面建立后1周、2周、3周和4周),效应中,group*model*time效应有统计学意义(F=3.181,P=0.028),group*time效应有统计学意义(F=25.307,P=0.001),time效应有统计学意义(F=248.009,P=0.000)其他效应均无统计学意义(P>0.05)。因此,分别分析不同造模时间点下的,group和time两个重复测量因素的方差分析,在造模时间点为2周和4周,只有时间效应有统计学意义(F时间=33.250,P时间=0.008和F时间=339.381,P时间=0.000),只针对时间因素进行单独效应的分析；在造模时间点为6周,交互效应有统计学意义(F时间×位点=30.954,P时间×位点=0.000)。针对位点和时间均进行单独效应分析,结果如表8所示(图3-2.C,表8)。即是说放射2周组内,未接受脂肪干细胞移植的放射创面和接受脂肪干细胞移植的放射创面与正常创面的愈合速度在造模后早期4周内无显著差异。同样的,放射4周组内,未接受脂肪干细胞移植的放射创面和接受脂肪干细胞移植的放射创面与正常创面的愈合速度在造模后早期4周内也无显著差异。但是放射6周组内,未接受脂肪干细胞移植的放射创面和接受脂肪干细胞移植的放射创面与正常创面的愈合速度在造模后第2、3、4周均有显著差异(F=127.416,P=0.008;F=346.649,P=0.003;和F=70.636,P=0.014)。该统计结果提示在造模后放射2周组、放射4周组和放射6周组各组内未接受脂肪干细胞移植的放射组和接受脂肪干细胞移植的放射组之间创面分别无统计学差异,从而为后续的脂肪注射移植建立了良好的创面前提条件。同时,提示了放射2周组、放射4周组和放射6周组的放射创面三组相比较,放射6周组的放射创面更适合于作为慢性创面模型。对于自体脂肪干细胞注射移植对放射创面的效果评价(图3-2.B,表9),三个重复测量因素分别为：放射开始造模时间因素model(放射后2周、放射后4周和放射后6周)、分组group(未接受脂肪干细胞移植的放射组和接受脂肪干细胞移植的放射组)、造模后观测时间因素time(创面建立后第5周、6周、7周、8周和9周),但是由于开始造模即放射后4周组,只有一个实验对象(其中一个对象由于注射后创面出现不可预计情况无法纳入统计),因此同时结合实际情况和探究目的(关注分组对治愈情况的影响),分别分析2周开始造模和6周开始造模情况下,group和time两个重复测量因素的方差分析,分组因素均无统计学意义(F分组=1.483,P分组=0.438；F分组=1.114,P分组=0.792),只有time效应有统计学意义(F时间=32.438,P时间=0.003；F时间=251.096,P时间=0.000)。对于放射2周组,未接受脂肪干细胞移植的放射组(此处简称放射组)和接受脂肪干细胞移植的放射组(此处简称移植组),时间效应有统计学意义(F时间=32.438,P时间=0.003)。对于放射6周组,未接受脂肪干细胞移植的放射组(此处简称放射组)和接受脂肪干细胞移植的放射组(此处简称移植组),时间效应有统计学意义(F时间=251.096,P时间=0.000)。该统计结果提示未接受脂肪干细胞移植的放射组和接受脂肪干细胞移植的放射组的创面愈合速度无统计学差异。2、创面组织学分析创面建立当日,在所有的正常创面和放射创面,没有观察到炎症反应。在创面建立后2周,所有正常组创面可见完整的上皮形成。关于急性炎症反应和慢性炎症反应,放射后4周组和放射后6周组的严重程度明显比放射后2周组增加。所有的放射组创面上皮化不完全。在创面建立后4周,所有正常组创面未观察到急性炎症反应。在所有的放射组创面,急性炎症反应较创面建立后2周时的情况有所减轻。尽管如此,仍然可以观察到急性炎症反应。在所有的放射组创面,慢性炎症反应明显减弱,然而放射后6周组的慢性炎症反应最为明显。所有的放射组创面上皮化不完全。在创面建立后9周,所有正常组创面未观察到急性炎症反应,仍可见轻度的慢性炎症反应。未接受脂肪干细胞移植的放射组和接受脂肪干细胞移植的放射组两组之间则较为相似,即在所有的放射创面慢性炎症反应明显减轻。未接受脂肪干细胞移植的放射组,慢性炎症反应较接受脂肪干细胞移植的放射组稍严重。但未接受脂肪干细胞移植的放射组和接受脂肪干细胞移植的放射组两组之间病例结果比较无显著性差异。所有组的创面完全上皮化。结论一、我们的结果显示在电离辐射诱导的慢性创面中,放射后6周建立创面模型更为合适。本实验中,与非放射区域的正常创面在5周完全愈合相比较,所有的放射创面的愈合明显推迟了大约4周。所有放射组创面的慢性炎症反应比正常创面明显。这提示剂量为18-Gy单次电离辐射对创面的愈合有抑制作用,并延迟了创面愈合这一过程。在创面建立后第4周,干细胞移植前,放射6周组的创面愈合速度与放射2周组和放射4周组的创面愈合速度相比,比正常组显著延迟。病理结果分析证实,在创面建立后第4周,放射6周组的创面慢性炎症反应的程度最严重。二、既往关于放射对干细胞的影响的研究主要是在体外实验中进行,或者是研究低剂量的放射所造成的影响,而本实验中我们小型猪背部接受放射损伤的区域直接分离培养脂肪源性干细胞进行分析。本实验研究了18Gy单剂量的电离辐射在实验动物原位组织损伤进程中放射后第2,4,6周分别对脂肪源性干细胞所造成的影响。我们的数据显示小型猪皮肤软组织暴露于18Gy单剂量的电离辐射后,放射损伤脂肪源性干细胞(r-ADSCs)和正常脂肪源性干细胞一样,仍然表达表面抗原标志物即CD29和CD90,而不表达造血和内皮系标志物CD31和CD45。与放射2周组和放射4周组相比,放射6周组的脂肪源性干细胞(r-ADSCs)的增殖能力和脂肪分化能力显著减弱。我们的数据有趣地显示了在诱导培养14天时,放射2周组放射损伤的脂肪干细胞的矿物质形成能力增强,放射6周组放射损伤的脂肪干细胞的矿物质形成能力减弱。然而正常组、放射2周组、放射4周组、放射6周组之间的有碱性磷酸酶活性测定显示的成骨分化能力组间在诱导后第7、14、18天均无显著差异。在诱导后第18天,正常组、放射2周组、放射4周组、放射6周组之间的由茜素红S染色显示的矿物质形成能力均无显著差异。这也许提示在电离辐射后的早期,活体内的脂肪干细胞的矿物质形成能力有短暂性的增强。就本实验中的慢性创面模型的下一步研究展望是揭示放射诱导损伤的脂肪源性干细胞的修复过程或者是放射损伤对脂肪源性干细胞的损伤的持续性。三、在术后即创面建立后4周和6周分别进行自体脂肪源性干细胞注射移植。在创面建立后4周,自体脂肪干细胞或是单纯的细胞培养液被注射在放射诱导的慢性创面。未接受脂肪干细胞注射移植的放射创面,其慢性炎症反应比较接受脂肪干细胞注射移植的放射创面轻度的增加。在创面建立后6周,即第一次脂肪干细胞注射移植后2周,接受脂肪干细胞注射移植的放射创面,其创面愈合速度稍快于未接受脂肪干细胞注射移植的放射创面。然而,接受脂肪干细胞注射移植的放射创面与未接受脂肪干细胞注射移植的放射创面两组之间的创面愈合速度无统计学差异。接受脂肪干细胞注射移植的放射创面与未接受脂肪干细胞注射移植的放射创面两组之间的组织学无明显差异。未来将进一步研究在慢性创面的治疗中怎样使用自体脂肪干细胞能达到更好疗效。
【作者】杨晓；
【导师】柳大烈；DaeguSon；
【作者基本信息】南方医科大学，整形外科学，2014，博士
【关键词】慢性创面；放射损伤的脂肪源性干细胞；正常脂肪源性干细胞；脂肪源性干细胞；电离辐射；动物模型；猪；细胞分化；创面愈合；

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